“?腫瘤微環(huán)境中靶點蛋白表達水平，浸潤的T細胞，及其他類型的免疫細胞與免疫檢查點抑制劑（ICI）的應(yīng)答密切相關(guān)。利用測序等生物信息學方法建立模型預測ICI的響應(yīng)”?

01

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PD-L1表達?

預計PD-L1的表達對Anti-PD-L1或anti-PD1的治療有一定的作用。因此，免疫組織化學(IHC)檢測PD-L1蛋白的表達已被應(yīng)用于臨床。目前，F(xiàn)DA已批準PD-L1IHC作為NSCLC患者anti-PD1治療的配套診斷。例如，pbrobrolizumab被批準用于PD-L1非小細胞肺癌患者(定義為PD-L1，至少50%的腫瘤細胞用于一線使用，至少1%用于二線使用)。盡管如此，PD-L1的表達仍然是免疫檢查點抑制劑（ICI）反應(yīng)一個不完全的預測因子。對多種腫瘤類型的多項研究發(fā)現(xiàn)PD-L1的表達與ICI反應(yīng)或OS呈正相關(guān)，而其他研究則未發(fā)現(xiàn)相關(guān)性（如頭頸部腫瘤等）。

PD-L1生物標志物研究結(jié)果矛盾的潛在原因包括使用不同的檢測方法、PD-L1表達的時態(tài)和ITH以及評估陽性程度的非標準化標準，例如PD-L1相對染色強度，和百分比等。此外，即使PD-L1的表達與反應(yīng)相關(guān)，也有許多低到無PD-L1表達的患者經(jīng)歷了持久的臨床受益。因此，PD-L1狀態(tài)可能不是臨床治療決策的一個足夠全面的獨立生物標記物。重要的是，一項對聯(lián)合使用anti-CTLA 4和anti-PD1的非小細胞肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，PD-L1染色和TMB是獨立的反應(yīng)預測指標，包含這兩種因素的多變量模型提高了預測的敏感性和特異性。最近，在keynote189三期臨床試驗中，有報道說PD-L1水平可能是在NSCLC患者一線治療中對pembrolizumab單抗加化療的反應(yīng)的預測。研究人員觀察到，PD-L1在各級表達水平上，對免疫治療加化療方案的應(yīng)答者的PD-L1表達增強，但隨著PD-L1閾值的放寬，PD-L1陽性表達的預測作用明顯減弱。作為另一個重要的警告，一些研究發(fā)現(xiàn)PD-L1表達的細胞類型也應(yīng)該考慮到。在黑色素瘤和尿路上皮癌患者的獨立隊列中，發(fā)現(xiàn)PD1在腫瘤浸潤的免疫細胞上的表達，而在腫瘤細胞本身上不表達，分別與抗PD1和抗PDL1的反應(yīng)有關(guān)。?

02?

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腫瘤浸潤淋巴細胞：密度、表型和多樣性?

人們認為，免疫檢查點抑制劑（ICI）治療，特別是anti-PD1和anti-PD-L1，部分是通過激活已有的腫瘤免疫應(yīng)答起作用的。因此，ICI反應(yīng)的另一個潛在預測因素是腫瘤內(nèi)腫瘤浸潤淋巴細胞(TILs)的密度。事實上，TIL密度是一些腫瘤類型的強陽性預后指標，而不考慮ICI治療。例如，一種被稱為免疫核心的指標，涉及對腫瘤中心和周圍的CD8 T細胞進行量化，是OS的一個強有力的預測因子，可以補充CRC中傳統(tǒng)的腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(TNM)分期或MSI狀態(tài)。值得注意的是，單細胞測序顯示CD4記憶T細胞也在對ICI 有反應(yīng)的人類黑色素瘤中富集。在抗PD1治療的背景下，據(jù)報道，IHC在腫瘤侵襲性邊緣測量的TIL密度與抗-PD1反應(yīng)密切相關(guān)，這種方法可能很有前途，但很難標準化，需要更多的數(shù)據(jù)來說明該方法的通用性。

越來越多的證據(jù)表明，影響ICI結(jié)果的不僅僅是TIL的位置和密度，還有TIL的表型。例如，雖然抗PD1治療后，抗CTLA 4的患者TIL濃度沒有明顯變化，但應(yīng)答與T效應(yīng)細胞活性指標CYT 50(以穿孔素1(PRF 1)和顆粒酶轉(zhuǎn)錄水平54的幾何平均數(shù)計算)的增加有關(guān)。值得注意的是，不論腫瘤類型如何，CYT與tmb都有顯著的相關(guān)性，這支持了這樣的觀點，即癌癥的免疫控制涉及T細胞介導的對來自nssnv的腫瘤新抗原的溶細胞反應(yīng)。

除了T效應(yīng)細胞活化表型外，其他T細胞表型標記也與ICI反應(yīng)相關(guān)。例如，TIL表面表達的PD1水平可能與抗腫瘤免疫反應(yīng)的效果有關(guān)。具體來說，對非小細胞肺癌患者TIL的分析顯示，在PD1表達的基礎(chǔ)上，有三種不同的CD8 T細胞。PD1表達最高的腫瘤群體稱為PD1Tumour(PD1T)，因為PD1T與慢性病毒感染相關(guān)的PD1hi細胞在轉(zhuǎn)錄上明顯不同。在三個分離的CD8 T細胞群中，只有PD1T細胞能夠在體外對自體腫瘤細胞產(chǎn)生細胞因子反應(yīng)，這表明該細胞群在腫瘤抗原特異性T細胞中富集。重要的是，治療前PD1T細胞水平與抗PD1應(yīng)答呈正相關(guān)；然而，這些結(jié)果仍有待于驗證隊列的驗證。相反，在小鼠體內(nèi)的研究表明，由于Treg細胞相互作用、染色質(zhì)重塑或轉(zhuǎn)錄重組，在慢性抗原暴露下，PD1高表達的T細胞可能表現(xiàn)出不可逆轉(zhuǎn)的耗竭表型。此外，一項對HNSCC患者的研究發(fā)現(xiàn)，高PD1表達的腫瘤內(nèi)T細胞百分比與切除后PFS 差直接相關(guān)，但這些患者未接受ICI治療，而HPV狀態(tài)可能是HNSCC的一個混雜變量。另一項針對抗PD1治療的非小細胞肺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤和外周血中積累的CD4 FOXP 3?PD1hi T細胞(4PD1hi)是腫瘤負荷的一種功能。重要的是，治療時外周血4PD1hi細胞計數(shù)的下降與這個隊列中OS的改善顯著相關(guān)。NSCLC相關(guān)的PD1T細胞的一個獨特的特征是它們表達趨化因子CXCL13，它專門招募B和T濾泡輔助(TFH)細胞。CXCL 13-TFH細胞-B細胞軸曾被證明與非ICI治療的CRC患者的長期存活有關(guān)。雖然人們普遍認為B細胞和TFH細胞不是抗腫瘤免疫應(yīng)答的主要成分，但這些發(fā)現(xiàn)表明腫瘤微環(huán)境的這一部分可能需要在ICI反應(yīng)的背景下進一步研究。

應(yīng)用新的單細胞RNA測序(scRNA-seq)平臺允許高分辨率的表型特征，這是不可能的批量測序方法。對32例經(jīng)ICIS治療的轉(zhuǎn)移性黑色素瘤患者的單細胞轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)進行了非監(jiān)督聚類，確定了兩種主要的腫瘤內(nèi)CD8 T細胞表型：記憶型和疲勞型。記憶樣TILs與疲勞TIL的比值與免疫檢查點抑制劑（ICIS）的反應(yīng)密切相關(guān).此外，還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子Tcf 7在具有記憶樣表型的T細胞中被選擇性表達。因此，CD8 tcf 7和CD8 tcf 7?TIL的比值與抗-pd 1治療的黑色素瘤患者的應(yīng)答和生存密切相關(guān)，即使在總T細胞浸潤沒有明顯差異的情況下也是如此。

一種有效的T細胞反應(yīng)涉及特異性抗原反應(yīng)T細胞克隆的激活和擴增.因此，腫瘤內(nèi)或外周T細胞庫的克隆結(jié)構(gòu)可能是與ICI反應(yīng)相關(guān)的腫瘤免疫原性的另一個指標。T細胞庫多樣性可以用兩種互補指標來量化：豐富度，即獨特的TCR序列數(shù)和克隆性，即序列分布的均勻性(低克隆性表示所有克隆的分布相等，高克隆性表示傾斜或寡克隆群體，少數(shù)克隆占主導地位)。腫瘤內(nèi)或外周T細胞的多樣性與ICI反應(yīng)之間的關(guān)系似乎是復雜的，因為一些研究發(fā)現(xiàn)治療前或治療后的克隆性水平與反應(yīng)呈正相關(guān)，而另一些研究表明，只有在治療中增加克隆性與抗-PD1應(yīng)答相關(guān)。另一項針對30例黑色素瘤患者的研究發(fā)現(xiàn)，TIL多樣性與抗-PD1反應(yīng)或存活無關(guān)，但沒有檢測治療后的變化。有趣的是，一項對29例經(jīng)抗PDL 1治療的尿路上皮癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，治療前外周T細胞克隆性與PFS和OS呈負相關(guān)，而T細胞內(nèi)克隆性與生存期無相關(guān)性。同樣，一項對25例轉(zhuǎn)移性胰腺癌患者的研究發(fā)現(xiàn)，抗CTLA 4治療的患者外周血T細胞克隆性與生存呈負相關(guān)，但與抗PD1無關(guān)。更復雜的是，先前的免疫治療暴露可能會影響T細胞儲備動力學在隨后的抗-PD1的使用。具體來說，在治療中，抗CTLA4治療的黑色素瘤患者體內(nèi)T細胞豐富度的增加與抗PD1反應(yīng)有關(guān)，而T細胞克隆性的增加與免疫治療中的抗PD1反應(yīng)有關(guān)。這些結(jié)果表明，需要做更多的工作來闡明腫瘤內(nèi)和外周T細胞多樣性作為ICI反應(yīng)指標的效用。?

03

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腫瘤微環(huán)境不只有T細胞?

許多其他類型的免疫細胞可能影響ICI的療效。雖然目前還沒有通過FDA批準的檢測方法來預測免疫檢查點抑制劑（ICI）的療效，但目前正在做的工作是破譯這些細胞類型對應(yīng)答率的影響。為了更全面地了解腫瘤的免疫微環(huán)境，從RNA測序結(jié)果中提取免疫細胞表型和豐度數(shù)據(jù)的方法已經(jīng)發(fā)展成。這種計算被應(yīng)用于治療前和治療后黑色素瘤患者的腫瘤樣本，發(fā)現(xiàn)抗-PD1反應(yīng)與CD8 T細胞和自然殺傷細胞的增加和巨噬細胞的減少有關(guān)。這一補充數(shù)據(jù)提示髓系細胞在ICI反應(yīng)中具有潛在的抑制作用。在一組獨立的黑色素瘤患者中，腫瘤相關(guān)巨噬細胞(TAMS)與不良的抗PD1反應(yīng)之間存在類似的相關(guān)性。

此外，在黑色素瘤患者中，骨髓源性抑制細胞(MDSCs)的低分化群體的外周血水平與抗CTLA 4反應(yīng)不佳有關(guān)。事實上，在一項利用機器學習來識別所有TCGA腫瘤樣本CYT預測參數(shù)的研究中，最關(guān)鍵的特征之一是缺乏MDSC 。該模型的另一個主要特征是CD8 T細胞、γδT細胞和自然殺傷細胞的富集，以及Treg細胞的耗竭。值得注意的是，免疫表型核心在兩組獨立的ICI患者中區(qū)分應(yīng)答者和非應(yīng)答者的敏感性和特異性都很高。在一項對腎癌患者的獨立研究中，在接受抗-PDL 1的患者中，高的瘤內(nèi)髓樣信號與PFS中位數(shù)下降近有關(guān)，再次強調(diào)髓系細胞對ICI反應(yīng)的抑制作用。值得注意的是，聯(lián)合使用VEGF抑制劑可使髓細胞含量高的腫瘤患者的中位pfs增加8倍以上，這表明髓系信號可能是選擇RCC患者聯(lián)合治療的有用的生物標記物。

髓系細胞的特異性亞群可能在調(diào)節(jié)T細胞排斥中起重要作用。據(jù)報道，LY6ClowF4/80巨噬細胞可調(diào)節(jié)T細胞對胰腺癌的排斥作用。這些巨噬細胞位于腫瘤微環(huán)境之外，它們協(xié)調(diào)了獲得性T細胞免疫特權(quán)的位點，并消除了它們，提高了免疫治療誘導T細胞依賴性腫瘤殺傷的能力?？傊?，對腫瘤微環(huán)境的檢查顯示出作為ICI療效的預測生物標記物的巨大前景。?

04

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轉(zhuǎn)錄和表觀遺傳標記?

RNA測序數(shù)據(jù)的生物信息學分析已被用于揭示與ICI反應(yīng)或耐藥性相關(guān)的全球腫瘤和微環(huán)境特征。一項研究確定了治療前的特征，包括28個黑色素瘤患者組中與抗PD1抵抗相關(guān)的26個轉(zhuǎn)錄亞信號。然而，在另外兩個獨立的黑色素瘤組中，這一特征與抗CTLA 4或抗PD1反應(yīng)無關(guān)，這表明它可能反映了分析過的原始隊列特有的特征。另一項對抗PD1治療的黑色素瘤患者的研究發(fā)現(xiàn)，治療前RNA表達特征與腫瘤克隆結(jié)構(gòu)的治療改變有關(guān)。據(jù)推測，由于腫瘤克隆結(jié)構(gòu)的改變與反應(yīng)和OS有關(guān)，治療前的RNA信號也可能是治療結(jié)果的預測。事實上，這一RNA特征與改善兩個獨立黑色素瘤組的存活率有關(guān)，其中一個只使用抗PD1，另一個用抗CTLA 4或抗PD1治療。

初步數(shù)據(jù)表明，這種炎癥基因特征在預測腫瘤類型中具有預測價值。最近的工作已經(jīng)利用單細胞轉(zhuǎn)錄組分析精細的細胞分辨率來確定與T細胞排斥相關(guān)的腫瘤細胞轉(zhuǎn)錄程序。這一特征是預測不良的ICI反應(yīng)和降低生存率在多個獨立的黑色素瘤患者隊列。值得注意的是，體外實驗表明CDK 4和CDK 6抑制可以逆轉(zhuǎn)這種T細胞排斥方案，從而為表達這一轉(zhuǎn)錄程序的腫瘤患者提供了一種潛在的聯(lián)合策略。

除了基因組和轉(zhuǎn)錄特征外，表觀遺傳改變也可能與對ICIS的反應(yīng)有關(guān)。利用DNA甲基化微陣列，與ICI反應(yīng)相關(guān)的表觀遺傳標記在NSCLC患者的獨立隊列中被識別和驗證。此外，單個基因FOXP3的甲基化狀態(tài)也可以預測ICI的應(yīng)答。

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